從獸醫角度，這是終極研究證據，因為使用狗作為損傷模型，證明氫水治療有利于皮膚損傷的修復。當然這種研究對于人類醫學來說，只能屬于動物實驗層次。
本研究探討了飲用富氫水對犬皮膚傷口愈合的影響。對每只犬的8個圓形傷口進行分析。實驗組用富氫水處理，每天3次，對照組用蒸餾水處理。對犬創面組織進行組織病理學檢查。用相應試劑盒檢測創面皮膚勻漿中成纖維細胞、炎癥細胞浸潤、新生血管平均數量、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)活性。采用實時熒光定量法檢測Nrf-2、HO-1、NQO-1、VEGF、PDGF的表達。我們觀察到，與蒸餾水相比，富氫水傷口的愈合率更高，平均愈合時間更快。組織病理學顯示，富氫水組的表皮平均厚度明顯低于蒸餾水組，平均血管數高于蒸餾水組。蒸餾水組MDA水平高于富氫水組，SOD水平低于富氫水組。qRT-PCR結果顯示，兩組間各基因表達均有顯著差異。富氫水處理可促進犬皮膚創面愈合，加速創面上皮化，減少炎癥反應，刺激創面愈合相關細胞因子的表達，縮短創面愈合時間。 
1.介紹
作為動物最大的器官，皮膚在防止動物致病微生物和創口方面起著至關重要的作用。由各種因素引起的皮膚傷口通常需要臨床獸醫處理。嚴重創傷的恢復與多種因素有關，如治療時間和治療策略等，可能導致不同的治療效果，影響傷口愈合的時間和效果。創面愈合涉及炎癥反應、氧化應激等一系列機制，在創面病理生理中起著重要作用。許多治療方法已用于臨床治療，包括光動力治療、遠紅外治療、脂肪組織提取治療和精氨酸基材料治療，以及基于抗炎治療策略的各種生物材料。
有研究報道，氫氣可以通過抗氧化作用發揮治療作用。氫氣具有最低的分子量，同時具有強大的抗氧化能力，從體內清除過量的活性氧物種(氧自由基)。1975年，DoleM發現高壓氫氣可以有效治療惡性皮膚腫瘤。臨床研究表明，氫療法在治療類風濕性關節炎、糖尿病、帕金森病和代謝綜合征方面具有潛在的治療潛力。Tomohiro等發現，氫分子可通過誘導HO-1等Nrf-2下游基因，激活Nrf-2抗氧化防御通路，改善高氧誘導的肺損傷。一些研究表明，吸入含氫氣體是臨床護理的新指南，重點是皮膚傷口的治療。
氫氣是易燃易爆氣體，危險且難以儲存。然而氫飽和水，即所謂的富氫水，安全且容易吸收，經常用于醫學。據報道，富氫水具有抗氧化和抗炎作用，降低促炎細胞因子水平，有效保護器官免受損傷。羥基自由基和過氧亞硝酸鹽(ONOO-)離子具有很強的氧化毒性，并可引起脂質過氧化、DNA損傷和蛋白質過氧化，導致細胞損傷。然而，溶解在水中的氫可以與它們發生反應，減少了隨之而來的損害。當氫氣進入體內并與自由基發生反應，只產生水，排出多余的氫氣。這意味著氫水可以安全地用于治療疾病而不會產生副作用。
以往的動物實驗研究均采用口服富氫水和注射富氫鹽水(HRS)作為氫氣主要給藥途徑。研究表明，富氫鹽水可以通過上調血紅素加氧酶(HO-1)的表達以及降低奎寧(NQO-1)來清除過氧化氫和活性氧(ROS)。此外，最近研究已經證明富氫水在動物和人類中的抗疲勞作用。富氫水還能誘導心肌細胞的抗凋亡作用，抑制大鼠腎組織中α、β-二羰基化合物和ROS的產生。另一項研究提示，使用富氫水可提高腭部創面恢復率。因此，富氫水已被證明是傷口治療的基本治療策略之一。盡管富氫水已被證明可以加速皮膚創傷的恢復，促進大鼠放療引起的皮膚損傷的愈合，但關于富氫水在犬皮膚創傷中的應用的信息很少。
在此，我們旨在探索富氫水是否能在犬模型皮膚傷口的恢復中發揮重要作用。這是第一個以獸醫研究為基礎的研究，目的是評估富氫水對狗皮膚傷口愈合的影響。目的:(1)比較富氫水與蒸餾水處理犬開放性傷口的愈合效果;(2)比較氧化應激和炎癥指標水平;(3)探討富氫水對犬皮膚創面恢復是否有治療價值。我們推測，富氫水可促進血管生成和提高組織抗氧化基因表達，從而促進創面愈合，加快創面愈合速度，使其成為一種安全有效的臨床治療方法。
2.材料和方法
2.1狗
12只健康雄性小獵犬(年齡:2-4歲;體重:9.0-11.3公斤)，在標準環境下飼養，并隨時提供標準的狗糧和水。麻醉前6小時停止進食和飲水。所有方法均符合《中華人民共和國動物倫理程序和指南》要求的良好動物規范。我們盡一切努力減少動物的痛苦，減少動物的數量。本研究未報告死亡病例，犬的精神狀態和飲食均正常。實驗結束后，所有動物均未被宰殺，所有犬均健康，均被動物保護組織收養。
2.2手術創口的形成
實驗犬隨機分為對照組和實驗組(n=6)。第0天在軀干背外側剪毛。置頭靜脈置管，采用異丙酚(0.65mg/kg)麻醉，氣管插管吸入3.5%異氟醚，術中實時監測實驗犬的生理狀態。
圖1損傷部位編號。
使用真皮活檢穿孔機在剃過的背部中線兩側各創建四個直徑為15毫米的圓形傷口。每個創面距離背中線20mm，相鄰創面距離25mm。從尾部到頭部，從左側到右側分別標記為A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4(圖1).術前24小時皮下注射美洛昔康0.1mg/kg，術后立即注射。每只狗都被關在一個籠子里，戴著伊麗莎白時代的項圈。創面每日用碘伏消毒。氫氣(99.99%,v/v)，由氫氣發生器(QL-500;以500mL/min的速度將其沖入400mL蒸餾水中10min達到飽和。術后所有犬只均可自由進食標準食物;對照組給予蒸餾水(400mL)，每日3次;試驗組給予飽和富氫水(400mL)，每日3次。每只狗每次只喝一小時的水以保持富氫水濃度不變，另一段時間則不喝水。
在手術、插管、類似鎮靜和監測后7、14、21和28天收集皮膚創面樣本;手術方式與皮膚創面模型相同，皮膚采用低張力縫合。手術部位每日用碘伏消毒。第7天取A1、B1處創面;第14天取樣A2和B2，第21天取樣A3和B3，第28天取樣A4和B4。所有的樣本都是用手術刀提取的。取樣后，用縫線縫合傷口，用碘伏消毒。將A1、A2、A3和A4樣品固定在4%的多聚甲醛中(20g多聚甲醛粉溶解在500mLPBS緩沖液中，然后用磁力攪拌器持續攪拌。用氫氧化鈉調節溶液pH)。B1、B2、B3、B4樣品置于−80℃冰箱中保存。
2.3.皮膚傷口檢查
分別于術后7、14、21、28d觀察富氫水組和蒸餾水組創面出血情況。觀察包括有無出血，炎癥滲出物特征，傷口愈合，有無傷口感染。在第3、7、14和21天拍攝傷口，并使用ImageJ軟件對傷口進行量化。
創面愈合率=(S0−Sn)÷S0×100%
Sn:7、14、21、28天創面面積，S0:0天創面面積。
測量犬皮膚創面愈合情況，直至創面完全被肉芽組織覆蓋;這個過程的時間就是傷口愈合的時間。
石蠟切片用于組織病理學檢查。H&E染色用于評價上皮厚度和新生血管，Masson染色用于膠原纖維。簡單地說，從每只狗中選擇5個部分，并從每個部分的不同區域隨機選擇10個視野。切片評估由兩名獨立的盲法觀察員進行。
氧化應激檢測采用皮膚組織丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平，檢測試劑盒說明(南京建城生物技術有限公司，南京，中國)。
使用TRIzolReagent(Invitrogen公司，Carlsbad,CA,USA)從皮膚組織中分離總RNA。采用SuperScriptFirstStrandcDNASystem進行逆轉錄，采用LightCycler480Real-TimePCRSystem進行qRT-PCR。
2.4.統計分析
所有數據采用獨立樣本進行統計分析t-使用SPSS22.0統計軟件進行檢驗。
3.結果
3.1.傷口愈合
3.1.1臨床傷口評估
圖2顯示，在第3天和第21天，富氫水組和蒸餾水組的皮膚創面面積存在顯著差異。第3天，蒸餾水組皮膚創面出血、水腫、炎癥反應明顯，富氫水組皮膚創面不明顯。第7天，富氫水組肉芽組織豐富，新生上皮細胞豐富，創面濕潤光滑，而蒸餾水組肉芽組織和新生上皮細胞較少，創面干燥無光，血痂痂大，有炎性滲出物。第14天，所有犬的皮膚組織缺損均充滿肉芽組織;富氫水組比蒸餾水組有更好的再上皮化，出現疤痕組織和毛發生長。第21天，富氫水組傷口幾乎完全重新上皮化。第28天，富氫水組創面愈合完全，蒸餾水組創面愈合不完全。
圖2實驗組HRW和對照組DW不同時間損傷情況。
3.1.2。傷口愈合率和平均愈合時間
實驗期間，蒸餾水組和富氫水組皮膚創面愈合率逐漸升高，直至完全愈合(圖3,表2)。第3天，富氫水組皮膚創面愈合率(17.57±0.55%)顯著高于蒸餾水組(1.59±0.55%)(p<0.05)。第7天，富氫水組皮膚創面愈合率(46.82±4.29%)顯著高于蒸餾水組(16.44±6.43%)(p<0.01)。平均傷口愈合時間(圖3B,表3)為(19.00±0.36d)，顯著高于蒸餾水組(22.00±1.10d)(p<0.05)。
圖3兩組動物傷口愈合情況A和愈合時間B
3.2.組織病理學
3.2.1傷口長度
皮膚組織病理分析結果(圖4)顯示，在第7天，蒸餾水組和富氫水組創面長度仍較大，創面覆蓋肉芽組織。第14天，富氫水組的皮膚創面長度明顯小于蒸餾水組，并顯示出更好的再上皮化(p<0.05)。
圖4HE染色顯示皮膚損傷長度
3.2.2愈合情況
富氫水組沿創面邊緣可見新上皮形成，角化細胞分化、表皮細胞分化、表皮發育、皮膚發育、角化。第14天，蒸餾水組出現未分化角質形成細胞。第21天，富氫水組上皮平坦度、腺體形成和上皮厚度明顯降低，而蒸餾水組上皮厚度不規則(圖5A)富氫水組在第28天完成再上皮化，出現結締組織，表明瘢痕組織的出現。第14天，富氫水組的平均表皮厚度(153.42±31.72μm)顯著低于蒸餾水組(193.28±45.80μm)(p<0.05;圖5B).第21天，富氫水組的平均表皮厚度(54.16±2.53μm)顯著低于蒸餾水組(123.54±46.14μm)(p<0.01)。第28天，所有皮膚創面均愈合，富氫水組與蒸餾水組平均表皮厚度無顯著差異。
圖5HE染色顯示兩組動物不同階段皮膚損傷病理改變特征。
3.2.3新血管形成
富氫水和蒸餾水組的新生血管結構在第7天達到最大值，但隨著時間的延長新生血管結構逐漸減少(圖5A、C、表4)。第7天，富氫水組新生血管結構數目(17.60±1.14)明顯高于蒸餾水組(8.60±2.97)(p<0.01)。第21天，富氫水組新生血管結構數(1.20±0.84)與蒸餾水組(3.20±0.81)比較，差異有統計學意義(p<0.01;圖5C,表4)。
3.2.4。膠原蛋白纖維
Masson三色染色后，膠原纖維染色為藍色，肌纖維染色為紅色。病理切片結果顯示，兩組的膠原纖維隨著時間的推移而增加(圖6)。富氫水組的膠原纖維在第21天正常配置，直到第28天與健康皮膚相似。蒸餾水組在第7~21天膠原纖維呈交錯和不規則分布，少于富氫水組。第28天，蒸餾水組出現致密的不規則膠原纖維沉積。
圖6Masson染色結果
圖7氧化指標數據(略)
圖8PCR分析結果(略)
3.3.氧化應激檢測
實驗期間，小鼠皮膚組織(圖7一個,表5)先升高(第7~14天)，后降低(第14~28天)。第7天，蒸餾水組皮膚組織MDA水平(31.05±4.51U/mg)明顯低于富氫水組(17.68±2.48U/mg)(p<0.01)。第14天，蒸餾水組MDA水平(41.40±2.74U/mg)顯著高于富氫水組(17.47±2.82U/mg)(p<0.01)。第21~28天，皮膚組織中MDA水平急劇下降，兩組間無顯著差異(p>0.05)。
實驗期間，小鼠皮膚組織(圖7B,表6)從第7天開始升高至第28天，而富氫水組則先降低(第7天至第14天)后升高(第14天至第28天)。第7天，蒸餾水組皮膚組織SOD水平(12.36±0.96U/mg)明顯高于富氫水組(22.82±1.57U/mg)(p<0.05)。第21天，蒸餾水組SOD水平(23.36±4.04U/mg)顯著低于富氫水組(31.23±6.13U/mg)(p<0.05)。第28天，蒸餾水組SOD水平(24.39±2.87U/mg)顯著低于富氫水組(33.78±7.11U/mg)(p<0.05)。 
Nrf-2基因在富氫水/蒸餾水比值中的表達在第7~21天差異顯著，在第14天差異顯著(圖7C)。HO-1基因在富氫水/蒸餾水比值中的表達在第7天和第21天有顯著差異(圖7D)。NQO-1基因在富氫水/蒸餾水比值中的表達在第7天和第21天有顯著差異，在第14天有顯著差異(圖7E)。 
3.4.生長因子檢測
富氫水/蒸餾水比值中VEGF基因表達在第7天和第14天有顯著差異(圖8A)。PDGF在富氫水/蒸餾水比值中的基因表達在第7天和第14天也有顯著差異(圖8B)。
4.討論
在本研究中，我們確定了富氫水治療對狗的皮膚傷口愈合的積極作用，這主要歸因于其抗氧化潛力。皮膚傷口愈合的金標準評估包括肉眼檢查傷口表面的上皮和皮膚傷口大小隨時間的減少。最近的研究表明，雌激素可能在分子水平上參與創面愈合過程。因此，在這項研究中使用的狗都是完整的雄性，以避免不同水平的雌激素。富氫水治療方案在第7天至第28天顯示出實質性效果;皮膚創面面積均小于蒸餾水組。氫水發現促進肉芽組織的快速形成比蒸餾水組縮短恢復時間,這可能是由于富氫水促進血管的形成在傷口愈合的早期階段和相對快速愈合的。在這里，富氫水上調抗氧化基因和生長因子基因的表達，促進傷口愈合。此外，在第7-14天，富氫水組創面長度也明顯短于蒸餾水組(圖4)。
膠原纖維是細胞外基質的主要成分，在組織中起結構支架的作用，在皮膚創面愈合過程中調節細胞增殖和遷移。因此，膠原纖維的含量是檢測皮膚創面愈合的重要參數。氫水組織表明,皮膚內的膠原纖維傷口網站觀察更常規和更高的內容相比蒸餾水組(圖6)從天7和21日。調節基因表達在PDGF刺激膠原蛋白合成和膠原酶的釋放(圖8b)。因此，PDGF基因表達升高導致富氫水組膠原纖維數量多于蒸餾水組。這也解釋了為什么富氫水治療后皮膚組織中的膠原纖維增加，可能是富氫水介導的皮膚傷口愈合的主要原則之一。
在皮膚創面愈合的早期階段，炎癥反應隨后創面區域再次上皮化，肉芽組織的建立伴血管新生。新生血管對傷口愈合和組織修復也很重要。新生血管為傷口提供營養和氧氣，支持角質形成細胞遷移，將間充質干細胞運送到皮膚，然后支持傷口再生。血管生成是一個由多種血管生成因子共同協調的過程，其中VEGF是調節血管生成過程關鍵步驟[36]的重要生長因子。同時，PDGF通過招募周細胞調節血管生成，促進皮膚創面愈合。在我們的實驗中,VEGF基因表達的(圖8),PDGF(圖8b)兩組表明,氫水組織表現出增強的能力為新血管形成的早期階段的皮膚傷口愈合(鹿)和符合的結果的新生血管性組織切片(表4圖5a、C)。因此,富氫水對皮膚創面血管生成的影響可能是通過增加VEGF和PDGF的表達，促進肉芽組織的形成來調控的。研究表明，VEGF在軟骨內骨形成的早期階段增加軟骨形成，導致骨形成和骨愈合[38]顯著增強。Fan等發現在子宮內膜修復中，VEGF阻斷顯著抑制了再上皮化。VEGF表達升高可促使皮膚創面再上皮化。因此，VEGF基因表達升高和血管新生是皮膚創面愈合過程中的積極信號。
Nrf-2是抗氧化反應的重要調節因子，可避免氧化損傷和氧化應激的發生。MDA是氧自由基對不飽和脂肪酸脂質過氧化作用的代謝物，間接反映了自由基損傷的嚴重程度。MDA水平的變化反映了組織中氧自由基含量的變化。SOD作為自由基的清除劑，其活性也反映了自由基[41]的數量。富氫水的抗氧化作用對促進傷口愈合至關重要。在本研究中，我們發現富氫水可激活Nrf-2抗氧化途徑，并影響狗皮膚組織中SOD活性和MDA水平。
NQO-1和HO-1基因是Nrf-2的下游靶點，這兩個基因受Nrf-2表達的調控，被認為是細胞內最重要的抗氧化機制之一.研究表明，氫分子可以激活肺組織中Nrf-2的表達，從而促進HO-1和NQO-1的表達.在我們的研究中，富氫水處理增加了Nrf-2的表達(圖7C，第7天至第21天)，然后上調其下游II期代謝酶HO-1(圖7D，第7至21天)和NQO-1(圖7E，從第7天到第21天)。Nrf-2可以觸發SOD的轉錄，降低皮膚組織中MDA的含量.本試驗第7~14天，蒸餾水組MDA含量顯著高于富氫水組(p<0.01)，且富氫水組SOD活性顯著高于蒸餾水組(p<0.05)。MDA作為氧化反應中間體之一，是脂肪酸氧化的標志;它的水平升高可能導致老鼠皮膚傷口受損和延遲愈合.Li等發現創傷脂質過氧化和SOD表達的增強促進了慢性潰瘍創面愈合.在糖尿病模型中，創面微環境中促炎細胞因子和氧化應激的增加導致創面愈合延遲.這說明SOD的活性反映了皮膚組織的氧化水平，較低的氧化水平可以避免氧化損傷，導致更快的愈合。Ohsawa等報道動物吸入2%氫氣可清除羥自由基(OH)和過氧亞硝酸鹽陰離子(ONOO-)，從而改善氧化應激誘導的細胞損傷.SOD可以催化超氧陰離子分解為氧和過氧化氫，這一步也需要氫的參與。富氫水為SOD提供更多的氫，參與氧自由基的清除;因此，富氫水通過增強SOD活力，清除羥自由基和超氧自由基，從而降低MDA含量，促進皮膚創面愈合。
5.結論
口服富氫水可增加肉芽組織血管數量，加速創面上皮形成，縮短創面愈合時間。富氫水可以增強狗的抗氧化能力，激活Nrf-2信號通路的表達，提高MDA、VEGF、PDGF的表達，降低SOD的表達。這些狗在遵循治療策略時沒有表現出不適。這些結果表明，富氫水是一種安全、有效的獸醫臨床治療犬皮膚傷口的方法。
該研究來自東北農業大學獸醫學院。
QiDD,DingMY,WangT,et al.TheTherapeutic Effectsof Oral In take of Hydrogen Rich WateronCut aneous Wound Healingin Dogs[J]. Veterinary Sciences, 2021,8(11):264. 如需氫健康類產品批發定制歡迎聯系13365334752或掃碼進行咨詢/以上產品價格批發價格詳詢
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